薄層色譜TLC是一種簡便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上,形成一薄層進(jìn)行層析時(shí)一即稱薄層層析。其原理與柱層析基本相似。
(1)薄層色譜TLC的特點(diǎn):薄層層析在應(yīng)用與操作方面的特點(diǎn)與柱層析的比較。
(2)吸附劑的選擇:薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區(qū)別在于薄層層析要求吸附劑(支持劑)的粒度更細(xì),一般應(yīng)小于250目,并要求粒度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預(yù)制薄層一般活度不宜過高,以Ⅱ~Ⅲ級(jí)為宜。而展開距離則隨薄層的粒度粗細(xì)而定,薄層粒度越細(xì),展開距離相應(yīng)縮短,一般不超過10厘米,否則可引起色譜擴(kuò)散影響分離效果。
(3)展開劑的選擇:薄層層析,當(dāng)吸附劑活度為一定值時(shí)(如Ⅱ或Ⅲ級(jí)),對(duì)多組分的樣品能否獲得滿意的分離,決定于展開劑的選擇。中草藥化學(xué)成分在脂溶性成分中,大致可按其極性不同而分為無極性、弱極性、中極性與強(qiáng)極性。但在實(shí)際工作中,經(jīng)常需要利用溶劑的極性大小,對(duì)展開劑的極性予以調(diào)整。
(4)特殊薄層:針對(duì)某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出,有時(shí)需采用一些特殊薄層。
?、?熒光薄層:有些化合物本身無色,在紫外燈下也不顯熒光,又無適當(dāng)?shù)娘@色劑時(shí),則可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光薄層進(jìn)行層析。展層后置于紫外光下照射,薄層板本身顯熒光,而樣品斑點(diǎn)處不顯熒光,即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質(zhì)多為無機(jī)物。其一是在 254nm紫外光激發(fā)下顯出熒光的,如錳激潔的硅酸鋅。另一種為在365nm紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光的,如銀激化的硫化鋅硫化鎬。
② 絡(luò)合薄層:常用的有硝酸銀薄層,用來分離碳原子數(shù)相等而其中C一C雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物,如不飽和醇、酸等。其主要機(jī)理是由于C一C鍵能與硝酸銀形成絡(luò)合物,而飽和的C一C鍵則不與硝酸銀絡(luò)合。因此在硝酸銀薄層上,化臺(tái)物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時(shí)飽和化合物由于吸附zui弱而Rfzui高,含一個(gè)雙鍵的較含兩個(gè)雙鍵的Rf值高,含一個(gè)三鍵的較含一個(gè)雙鍵的Rf值高。此外,在一個(gè)雙鍵化臺(tái)物中,順式的與硝酸銀絡(luò)合較反式的易于進(jìn)行。因此,還可用來分離順反異構(gòu)體。
③ 酸堿薄層和PH緩沖薄層:為了改變吸附劑原來的酸堿性,可在鋪制薄層時(shí)采用稀酸或稀堿以代替水調(diào)制薄層。例如硅膠帶微酸性,有時(shí)對(duì)堿性物質(zhì)如生物堿的分離不好,如不能展層或拖尾,則可在鋪薄層時(shí),用稀堿溶液0.1~0.5NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。例如豬屎豆堿在以硅膠為吸附劑時(shí),以氯仿-丙酮一甲醇(8:2:1)為展開劑Rf<0.1,采用堿性硅膠薄層用上述相同展開劑,Rf值增至0.4左右。說明豬屎豆堿為--堿性生物堿。
?。?)應(yīng)用:薄層層析法在中草藥化學(xué)成分的研究中,主要應(yīng)用于化學(xué)成分的預(yù)試、化學(xué)成分的鑒定及探索柱層分離的條件。
用薄層層析法進(jìn)行中草藥化學(xué)成分預(yù)試,可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件,有針對(duì)性地進(jìn)行。由于在薄層上展層后,可將一些雜質(zhì)分離,選擇性高,可使預(yù)試結(jié)果更為可靠。
?。?)中草藥中的應(yīng)用
以薄層層析法進(jìn)中草藥化學(xué)成分鑒定,要有標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行共薄層層析。如用數(shù)種溶劑展層后,標(biāo)準(zhǔn)品和鑒定品的Rf值、斑點(diǎn)形狀顏色都*相同,則可作初步結(jié)論是同一化合物。但一般需進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對(duì)。
用薄層層析法探索柱層分離條件,是實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法。在進(jìn)行柱層分離時(shí),首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑。在洗脫過程中各個(gè)成分將按何種順序被洗脫,每一洗脫液中是否為單一成分或混合體,均可由薄層的分離得到判斷與檢驗(yàn)。通過薄層的預(yù)分離,還可以了解多組分樣品的組成與相對(duì)含量。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件,即可將此條件用于干柱層析。但亦可以將薄層分離條件經(jīng)適當(dāng)改變,轉(zhuǎn)至一般往層所采用洗脫的方式進(jìn)行制備柱分離。利用薄層的預(yù)分離尋找柱層的洗脫條件時(shí),假定在薄層上所測(cè)得的Rf值一樣品在柱層中的比移率(R)。這是由于在薄層展開時(shí),薄層固定相中所含的溶劑經(jīng)過不斷的蒸發(fā),而使薄層上各點(diǎn)位置所含的溶劑量是不等的,靠近起始線的含量高于薄層的前沿部分。但若嚴(yán)格控制層析操作條件,則可得到接近真實(shí)的Rf值。用薄層進(jìn)行某一組分的分離,其Rf值范圍,一般情形下為0.85>Rf>0.05。此外,薄層層析法亦應(yīng)用于中草藥品種、藥材及其制劑真?zhèn)蔚臋z查、質(zhì)量控制和資源調(diào)查,對(duì)控制化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程,反應(yīng)副產(chǎn)品產(chǎn)物的檢查,中間體分析,化學(xué)藥品及制劑雜質(zhì)的檢查,臨床和生化檢驗(yàn)以及毒物分析等,都是有效的手段。