體積排阻色譜SEC在樣品前處理中,有著*的作用,今天小編就帶您一起探尋一下GPC的原理,以及它在樣品前處理中的出色應用,一起來學習吧!
1.定義
體積排阻色譜法(Size exclusion chromatography,SEC)是利用多孔凝膠固定相的*特性,而產(chǎn)生的一種主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來進行分離的方法,它又稱為空間排阻色譜法(Steric exclusion chromatography)。
2.分類
流動相:水;凝膠過濾色譜(GFC)
流動相:有機相; 凝膠滲透色譜(GPC)
3.固定相
填料:多孔凝膠(軟性凝膠和剛性凝膠);
特點1:表面分布大小不一的小孔(如圖)
特點2:凝膠顆粒間存在空隙
4.分離
特點1:
化合物按照分子量大小,分為小分子,中等分子、大分子。
小分子: 能通過小孔、中孔、大孔、空隙;
中等分子:能通過中孔、大孔、空隙;
大分子: 被排阻在外,只能通過填料空隙。
特點2:
分子量越小,越能通過更多不同的孔徑的孔,分子量越大,只能通過一些較大孔徑的孔,分子量足夠大*被排斥在外,而不能通過孔,只能通過填料間的空隙。
特點3:
能通過的孔越多,所走的距離越長,出峰越慢;能通過的孔越少,所走的距離越短出峰越快。
5.原理
基于分配理論:
6.確定分子量大小
如同色譜質(zhì)譜的定量分析一樣,通過標準曲線法來定量未知樣品的分析物質(zhì)的濃度。在GPC中組分從柱中的洗脫體積(Ve)與分子量(M)存在對應關(guān)系lgM- Ve,我們可先通過配置好的已知分子量的化合物分子,進樣后,在凝膠柱上存在對應的洗脫體積,來配制標準曲線,在相同色譜條件下,未知的物的分子量,可以通過其洗脫體積,在準曲線上找到對應的分子量。
A: 分子量為106, 對應洗脫體積為V0
B:分子量為103 , 對應洗脫體積為V0+VP
X: 未知物,對應的洗脫體積為Vx, 可求得其分子量大小
7.兩個極限
極限一:排阻極限
如果要分離的物質(zhì),分子量足夠大,比填料的大孔徑都大,所有分子都將被排斥。
極限二:滲透極限
如果要分離的物質(zhì),分子量足夠小,比填料的小孔徑都小,所有分子都被滲透。
結(jié)論:體積排阻色譜只能分離凝膠柱處于滲透極限對應化合物分子量A和處于排阻極限對應化合物分子量B之間的物質(zhì)。
8.舉個例子(土壤中的多環(huán)芳烴的分離)
圖中的藍色為為土壤萃取物的紫外吸收曲線,可以發(fā)現(xiàn),色譜峰型較寬,只出現(xiàn)一個混雜的色譜峰,如不處理,將難以進行定量分析,黑色線為經(jīng)過SEC處理的土壤提取物,當?shù)弥喹h(huán)芳烴流出的時間后(收集點),在其流出時間處收集(紅色部位),將收集物在反相液相色譜上分析,得到如下色譜圖:
經(jīng)過SEC處理的收集物(多環(huán)芳烴),在HPLC上 得到了好的分離,干擾性雜質(zhì)(玉米油、DEHP等)也得到了很好的去除效果。另外GPC得一個典型的應用,就是在農(nóng)藥殘留分析中,去除油脂,大分子蛋白、色素。SEC提供了常規(guī)SPE和LLE難以分離處理的復雜基質(zhì)樣品的前處理手段。