色譜柱使用過程中你是否有遇到分離度的問題:
減小粒徑,擔(dān)心柱壓太高?
增加柱長,擔(dān)心分離度增加幅度太小?
來來,小編來教你一招
試試縮短柱長吧
既能提高分離度,還能降低成本
一、有趣的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,有圖有真相
以三七含量測定為例,色譜柱柱長從250mm縮短為150mm,一起來看看譜圖變化吧。
(1)Athena C18-WP 4.6 × 250mm, 5μm
(LAEQ-462572,三七含量測定)
(2)Athena C18-WP 4.6 × 150mm, 5μm
(LAEQ-461572,三七含量測定)
綜上,三七含量測定時(shí),色譜柱柱長從250mm縮短為150mm,人參皂苷Rg1和相鄰雜質(zhì)峰的分離度從1.41增大到了1.74。
二、透過現(xiàn)象看本質(zhì),不違背基本規(guī)律
通常較長的色譜柱,柱效更高,分離效果更好,而上述的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象是相反的,它是怎么發(fā)生的呢?我們來分析一下:
流動相的梯度程序如下:
從出峰時(shí)間,我們可以估算Rg1出峰時(shí)流動相的組成(流動相中乙腈的比例):
我們可以看出,和Athena C18-WP 4.6 × 250mm, 5μm相比,采用Athena C18-WP 4.6 × 150mm, 5μm,人參皂苷Rg1出峰時(shí)乙腈的比例更低,我們知道,反相色譜分離模式,降低流動相中有機(jī)相的比例,有利于提高分離度,而此時(shí)由于長度縮短、柱效降低引起的分離度下降起到次要作用,綜合結(jié)果,分離度得到改善。
三、現(xiàn)實(shí)條件不滿足,怎么辦?
如果我們手頭沒有150mm的色譜柱,實(shí)驗(yàn)又比較著急,我們還可以嘗試提高流速的方法,下邊還是以三七含量測定為例子,采用Athena C18-WP 4.6 × 250mm, 5μm,流速從1.0ml/min提高到1.2ml/min,人參皂苷Rg1出峰時(shí)間提前,出峰時(shí)乙腈的比例更低,人參皂苷Rg1和相鄰雜質(zhì)的分離度從1.41提高到1.52。
溫馨提示:此例子僅是為了提供一個(gè)思路,雖然通過改變流速,Rg1和相鄰雜質(zhì)峰分離改善,但同時(shí)引起Rb1受到雜質(zhì)峰的干擾,此案例該方法不可行。
四、總結(jié)
梯度洗脫時(shí),遇到分離度問題,可以嘗試縮短柱長或者提高流速的方法,此時(shí)是出峰時(shí)有機(jī)相比例降低造成的分離度提高和柱效降低引起的分離度下降的一個(gè)較量。如果前者起主要作用,分離度可以得到改善,如果后者起到主要作用,會導(dǎo)致分離度下降。
五、彩蛋時(shí)刻
三七含量測定過程,經(jīng)常會遇到分離度、基線漂移等問題,各個(gè)廠家也紛紛推出柱,采用安譜Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm(LAEQ-461571),即可輕松實(shí)現(xiàn)柱的效果。
1. 良好的分離性能
采用安譜實(shí)驗(yàn)Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm(LAEQ-461571)色譜柱,按照2015版《中國藥典》條件,做三七含量測定,三七皂苷R1的柱效遠(yuǎn)大于4000,人參皂苷Rg1和相鄰雜質(zhì)峰分離度達(dá)到2.1。
2. wan美的批次重現(xiàn)性
采用3個(gè)不同批次的Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm(LAEQ-461571)色譜柱,做三七含量測定,三七皂苷R1的柱效都遠(yuǎn)大于4000,三七皂苷R1的出峰時(shí)間以及人參皂苷Rg1和相鄰雜質(zhì)峰的分離度都能得到很好的重現(xiàn)。
3. 優(yōu)異的穩(wěn)定性
采用Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm(LAEQ-461571)色譜柱,做三七含量測定,連續(xù)進(jìn)供試品溶液100針,三七皂苷R1的柱效、人參皂苷Rg1和相鄰雜質(zhì)峰的分離度保持穩(wěn)定,Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm(LAEQ-461571)色譜柱具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。